Resumen

Fui un infectólogo clínico, pero hace algunos años decidí dedicarme a la microbiología, y desde entonces estoy en mi laboratorio y ya no veo pacientes. En el último tiempo mi laboratorio ha participado activamente en el desarrollo de nuevas técnicas, ya que nuestra obligación no sólo es hacer los exámenes para la Clínica Mayo, de Rochester, sino que para muchos otros hospitales y clínicas. El laboratorio de microbiología emplea a cerca de 300 personas y se procesan mas de un millón de muestras al año. Tenemos también clientes en todo el mundo, entre ellos la Clínica Alemana de Chile. Aunque ya tengo mis años, decidí hacer la beca de microbiología sólo hace unos años, para evitar la crisis de la edad media. Como cuando yo era infectólogo, las técnicas de biología molecular eran algo incomprensibles y me intimidaban. Trataré de revisarlas en forma simple para aquellos de ustedes que no están familiarizados con ellas.

En el Parque Nacional de Yellowstone existen unas termas en que la temperatura de las aguas es de 70ºC. Ahí crece la Thermas aquatica, el organismo que tiene una DNA polimerasa que funciona muy bien a 70-75ºC. Es la enzima que se utiliza en la reacción de polimerasa en cadena (PCR), la que seguramente conocen, o han oído hablar de ella. Básicamente, hay tres pasos importantes: se desnaturaliza el DNA objetivo, se incuba con los primers y luego se aumenta la temperatura a cerca de 70ºC, permitiendo que la polimerasa haga su trabajo. Así se obtiene una nueva hebra de DNA, a partir del DNA inicial, y el proceso se repite de nuevo, una y otra vez, según la temperatura.

Además de la PCR convencional, existe la PCR en tiempo real (PCRtr). Se discute mucho respecto a si “PCR en tiempo real” es el término apropiado para llamarla, porque si los infectólogos son compulsivos para nombrar las cosas, los microbiólogos son peores. Significa un ciclo térmico rápido que permite completar la reacción de PCR en minutos en vez de horas, y en cada ciclo de la reacción es posible verificar que el producto esté presente, es decir, comprobar la presencia del objetivo inicial. Los términos importantes son dos: los ciclos térmicos rápidos y la verificación del objetivo en tiempo real. Lo de “tiempo real” se refiere, entonces, a la capacidad de detectar el producto al final de cada ciclo PCR.

¿Cómo se puede acelerar la reacción de PCR? Con ingeniería termodinámica simple y cuando la vemos nos preguntamos por qué no se nos ocurrió a nosotros, ya que los que lo inventaron se hicieron ricos. Simplemente, se incrementa la relación superficie/volumen de la mezcla de reacción y después se desarrollan sistemas que permiten cambiar la temperatura en forma rápida. Cuando aprendí por primera vez la PCR a fines de los 80 se usaban baños de agua. Podrán imaginar la ineficiencia. Ahora todo se hace automáticamente, en tubos. La mezcla de reacción de PCR y el DNA objetivo van en un tubo capilar y, por la alta relación superficie/volumen, imagínense el intercambio de temperatura que es posible con un tubo capilar. Los ciclos térmicos rápidos se consiguen con intercambios rápidos de aire en algunos equipos, pero hay también algunos con placas cerámicas de alta conductividad térmica y otros que lo producen básicamente con bloques de calentamiento rápido.

La tecnología que usamos en mi laboratorio fue la primera desarrollada por Boehringer-Mannheim. Comenzamos a trabajar con ellos hace dos años y medio. El Light Cycler es como una cafetera para café instantáneo, muy pequeño, compacto, no ocupa mucho espacio. Básicamente, hay un elemento calentador como un secador de aire sofisticado que sopla aire y un ventilador que, al cambiar de velocidad, afecta la temperatura del aire. Es tan simple como eso y los cambios rápidos de temperatura permiten que la PCR progrese muy rápidamente.

Para analizar las ventajas de la PCRtr, veamos brevemente la PCR al estilo antiguo. Debíamos hacer la reacción de la polimerasa, lo que tardaba horas en vez de minutos, y detectar el DNA objetivo usando electroforesis en gel u otro método engorroso. Muchos de los presentes habrán tenido que realizar una electroforesis en gel y saben de lo que estoy hablando. Permite determinar el tamaño del DNA producto de la PCR, se puede usar fragmentos de restricción para identificar polimorfismo, es posible cortar el DNA en fragmentos en el gel y se puede comparar una cadena única de DNA con una salvaje, para observar la presencia de mutaciones que modifican la movilidad en la EF. Después nos cambiamos a los BLOTS y ahora a las técnicas de microtitulación por captura o ELISA. A comienzos de los 90 tuve un alumno de postgrado de Japón, quien trabajó en análisis de SSTP, un gel de poliacrilamida de alta resolución. Se tiñe con plata y, por ejemplo, muestra una cadena de DNA del bacilo de la tuberculosis con una mutación CAT-G involucrada en la resistencia a isoniacida. El proceso duraba tres días, y estábamos muy emocionados de tener una técnica tan rápida para determinar genes involucrados en la resistencia a antimicrobianos. Ahora, con los ciclos rápidos de la PCRtr lo hacemos en 30 minutos.

En los sistemas nuevos, hay muchos que usan el sistema de ciclos rápidos, que es un sistema de detección homogénea de PCR. Todo está en el mismo tubo, el DNA objetivo y la PCR, y la detección también se hace ahí, sin abrir el tubo, con lo que hay menos problemas de contaminación. Demora de 20 a 30 minutos. Hay muchas maneras actualmente disponibles para la detección, pero me referiré de manera más específica a la tecnología "FRET", que es la que se utiliza en mi laboratorio. Sus principios son: se tiene el DNA objetivo, se incrementa la temperatura a cerca de 90ºC como paso de desnaturalización y después se enfría a 50ºC. Está el primer y hay dos sondas FRET. A 50ºC los primers se anillan, pero también se anillan las sondas. En esta fase de anillamiento las sondas, al ser excitadas con una longitud de onda determinada, transmiten la energía del colorante verde al rojo, y hay fluorescencia roja. Es una transmisión y emisión de resonancia fluorescente, por lo que se llama FRET (Fluorescence Resonance Emission Transmission). Cuando no hay acoplamiento tenemos sólo fluorescencia verde, porque no se excita la tonalidad roja. A los 70ºC, la polimerasa no sólo une un nucleótido nuevo sino que suelta la sonda, así que ésta se puede usar de nuevo, en la etapa siguiente de amplificación. Así podemos medir la presencia de producto en cada ciclo de PCR.

Es una técnica muy sensible, está todo automatizado y determinado por software. Permite detectar muy pocas copias del objetivo. Un número importante de copias se detecta en cinco ciclos de PCR, lo que es cerca de cinco minutos.

Las ventajas de la PCRtr son la reducción considerable de los requisitos de trabajo en comparación con la PCR convencional. Créanlo o no, es bastante barata. Como es tan rápida, se hace de una vuelta, no hay que estar mucho tiempo, no se necesita correr geles, disminuye el potencial contaminación de la muestra, que es uno de los problemas de la PCR. Todo está en el mismo tubo, el que se cierra una vez que el DNA objetivo se coloca dentro de él y no se abre más. No sólo podemos hacer identificación, sino que además podemos hacer detección de polimorfismo de un sólo nucleótido (SNIP), al fundir curvas en el software. También permite hacer clonificación. Los microbiólogos nos hemos convertido en bioquímicos, vemos constantes de variabilidad muy pequeñas, menores de 20% entre muestras consecutivas. Es una técnica muy sensible y específica.

Básicamente, la mayoría de las patentes para esta tecnología han sido y son de Roche que, de hecho, compró Boehringer Mannheim hace un año. Tras algo de debate legal seguimos trabajando con ellos.

Sucede que hay una proliferación de pequeñas compañías en los Estados Unidos, en las cuales yo no invertiría. Como la mayoría de las patentes las tiene Roche, no sabemos cómo estas compañías van a conseguir legalmente la tecnología. Probablemente, algunos de ustedes conocen los formatos de PCRtr como los Techman 5700 y 7700, que nosotros usamos en el pasado. Creemos que no están ni cerca de la utilidad de la tecnología del Light Cycler. Tenemos cinco y vamos a tener dos más, cuestan algo así como 57.000 dólares. Hay una compañía que está buscando los usos de esta técnica fuera del laboratorio. El Departamento de Defensa de los Estados Unidos financió esta compañía norteamericana para que desarrollara un ciclador térmico rápido que se pudiera arrojar desde helicópteros o aviones, y sirviera para detectar en terreno agentes infecciosos usados por el bioterrorismo, como el ántrax. Ahora quieren adaptar esta tecnología para la oficina del médico. Se coloca la muestra en el equipo, saca el DNA y todo el análisis se realiza en cosa de una hora. Se puede tirar desde un helicóptero y funciona a batería, aunque no lo crean.

Como somos especialistas en enfermedades infecciosas, cuando desarrollamos una nueva técnica debemos mirar la cascada de pasos. La técnica de PCR se puede hacer tan rápido que demora más el transporte de la muestra al laboratorio que el tiempo que se ocupa en hacer el análisis. En algunas instituciones hay más demora en redactar el informe que en hacer el examen. Pero lo extremadamente importante es la recolección de la muestra. Por lo menos, desde que soy el jefe, en mi laboratorio se usa lo que llaman “la doctrina Cockerill”, pero es lo que debemos hacer como microbiólogos. El criterio es que, cuando se crea una nueva tecnología, se debe evaluar su precisión. Si no es igual a la tecnología convencional o mejor, probablemente no se la debe usar. Si es mucho más sensible, pero mucho más cara, se puede considerar. No sé cómo es en Chile, pero actualmente en los Estados Unidos interesa sacar al paciente del hospital o de la clínica lo antes posible, porque el costo del hospital es alto. También es importante el costo de los reactivos, ya que observamos un aumento de 10 a 15% cada año, muy por encima de la inflación. Se necesita personas adiestradas que la realicen y son cada vez más difíciles de encontrar, y, además, espacio donde hacerla. El espacio es un gran problema, incluso en Rochester, Minnesota, donde la gente maneja enormes autos en las calles. En el laboratorio también tenemos problemas de espacio, lo que es costoso. El ahorro junto a la cama del enfermo es difícil de determinar, pero si tienen un paciente con sospecha de tuberculosis y el diagnóstico se puede confirmar en treinta minutos, va a haber un impacto en el costo del aislamiento. Por supuesto que también interesa el asunto del costo relacionado con bacterias multirresistentes, como el SAMR y el VRE. Esta tecnología permite decidir que un enfermo, por ejemplo, no se hospitalice hasta que se haya hecho el screening o que no se opere antes de que se haya estudiado secreción nasal y rectal para SAMR y VRE. Por ello, puede tener un importante impacto en las infecciones nosocomiales.

En cuanto a sus aplicaciones, cuando lo pensamos por primera vez, consideramos que sería una técnica muy útil en la identificación de microorganismos no cultivables como la Bartonella, el agente de la enfermedad de Whipple y otros, pero también en la identificación rápida de microorganismos que necesitan largos períodos de crecimiento, como el bacilo de Koch, o algunos de nuestros hongos, que ustedes afortunadamente no tienen, como Histoplasma, que demora cuatro semanas en crecer.

Pero también se podría probar para el diagnóstico de cualquier microorganismo que no requiera cultivo o examen de susceptibilidad, como el estreptococo del grupo A. Cuando decidimos extender la tecnología a otros microorganismos, elegimos el estreptococo, el que causa las faringitis. Me sorprendió descubrir que en Europa ni siquiera se intenta detectarlo, ya que se usa terapia empírica. No sé lo que sucede en Chile, pero en Rochester hacemos 40.000 exámenes al año y se estima que en todo Estados Unidos se hacen entre 75 y 100 millones. Un chico que tiene faringitis estreptocócica no está feliz, pero los laboratorios están muy felices, ya que estiman un mercado de 40 millones de exámenes al año. Además de la faringitis, hemos tenido problemas con la escarlatina y, como se dijo ayer, suele haber problemas graves con la fasceítis necrotizante. El método convencional para el diagnóstico es el agar sangre, buscando la hemólisis. En los Estados Unidos se hace un test rápido, ya que los médicos de la comunidad quieren estar seguros si el estreptococo es del grupo A o no. Hace algunos años comparamos el test rápido de Becton Dickinson con el cultivo, considerándolo como el padrón oro, y encontramos que su sensibilidad es de 58%. En el mismo grupo de pacientes probamos la técnica del Light Cycler, utilizando la exotoxina pirogénica, presente en todos los grupos de estreptococo. Consideramos como padrón oro cualquier resultado positivo, ya sea de cultivo o de antígeno rápido. La sensibilidad del Light Cycler fue de 91%, comparado con el cultivo, que obtuvo 86%.

El examen de PCR que acabo de mostrar es muy fácil de realizar. Básicamente, se necesita lisar los microorganismos y hemos desarrollado maneras rápidas de hacerlo. Para el estreptococo del grupo A, el lisado demora treinta segundos. Se concentra el frotis faríngeo, se resuspende y se lisa, todo muy rápido.

Realmente nos impresionaron los resultados, en cuanto a la precisión de la técnica. Estábamos seguros de que la PCR iba a ser útil; sin embargo, la PCR convencional no lo era tanto, excepto para algunos patógenos muy especiales. Con la nueva técnica todo se hace muy rápido, para los más diversos agentes. Por ejemplo, los tiempos de cultivo son, para estreptococo de grupo A, dos días; para Legionella, diez días; para Bordetella pertussis, siete; para varicela-zoster y herpes simplex, cinco; para citomegalovirus, 24 horas. Al comparar con los 30 minutos que demora la nueva técnica, la disminución del tiempo es dramática. Respecto al tiempo de personal, en los Estados unidos existen normas de tiempo para calcular el tiempo de personal que se utiliza en cada técnica. Para el estreptococo grupo A, el tiempo de hacer un antígeno rápido y un cultivo convencional es de siete minutos por análisis. El Light Cycler ocupa tres minutos, lo que es también una disminución importante en el tiempo. En cuanto a la sensibilidad del Light Cycler, hay un aumento de 7% en la sensibilidad para estreptococo grupo A, respecto al padrón oro. Para Legionella, la sensibilidad no varía, pero este trabajo se hizo con cepas de archivo, en 20 muestras de lavado broncoalveolar que estaban guardadas hacía 20 años. Como Legionella es extremadamente rara, es imposible hacer un estudio prospectivo. Con Bordetella pertussis ocurre algo increíble, ya que la sensibilidad mejora en 300%. Esto hace pensar que se ha estado subdiagnosticando muchísimo este microorganismo, incluso en los estados Unidos. Con varicela zoster hay 91% y con herpes simplex, incluído el herpes genital, 23% de aumento respecto al cultivo celular. El CMV en orina también aumenta enormemente. Con otros microorganismos también se demuestra incremento.

Con estos resultados, es obvio que las aplicaciones de esta técnica son enormes. Hace tres meses solicité a mi grupo de trabajo que confeccionara una lista de los microorganismos objetivo para aplicar la técnica. La lista es muy larga. Aparecen 99 candidatos. Un tecnólogo sugirió que, para redondear a 100, estudiáramos también los virus computacionales.

Al analizar el costo del Light Cycler, hay que tener cuidado, ya que no existen kits de análisis disponibles y no sé si van a aparecer pronto. Comparando los valores de la materia prima de los insumos, el Light Cycler tiene costos que son más o menos la mitad de los de antígeno rápido y cultivo.

En conclusión, la PCRtr tiene implicaciones inmediatas e importantes para los métodos diagnósticos y para la microbiología clínica. Es de muy alta sensibilidad, tiempos muy cortos, es fácil de realizar y relativamente barata. En muchos casos, seguramente, reemplazará al cultivo como padrón oro en la identificación de microorganismos. Es necesario que por Roche u otras empresas elaboren kits. También es indispensable ver la normalización de los formatos de estudio en el mundo, para que en todas partes se usen los mismos tipos de formato de análisis y sea posible comparar.