Resumen

El Transplante (Tx) Cardíaco ya en su cuarta década de implementación, permanece como la única terapia ampliamente reconocida para el tratamiento de la insuficiencia cardíaca terminal refractaria a tratamiento médico. Los notables avances respecto de la técnica quirúrgica, anestesia, circulación extracorpórea, protección miocárdica y mecanismos de soporte, así como una mejor comprensión en la selección de los pacientes y de inmunosupresión, han ido mejorando la sobrevida durante el primer año, pero en el largo plazo los cambios no han sido significativos.

En los recientes resultados del Registro de la Sociedad Internacional para Tx de Corazón y Pulmón sobre 55359 transplantes cardíacos reportados, se aprecia que la sobrevida a un año es de 81% mientras que la sobrevida actuarial en un período de 16 años es alrededor de 35%, observándose una mortalidad constante de 4%/año desde el año 1 al 14 y una curva que tiende a aplanarse los años 15 y 16. La causa principal de muerte dentro del primer año corresponde a la falla primaria del injerto. Pasado este período, la vasculopatía del injerto cardíaco ocupa el primer lugar seguido de la falla inespecífica del mismo y las enfermedades malignas (1). Por lo tanto y de acuerdo a estos antecedentes, se puede consignar que un problema primordial a resolver en el Tx cardíaco, se refiere a la capacidad de actuar sobre las distintas manifestaciones de rechazo en su etapa aguda como crónica, así como poder evitar las consecuencias de una terapia inmunosupresora que se mueve en un delicado equilibrio entre “lo mucho” (infección, enfermedades proliferativas) y “lo poco” (rechazo). El rechazo crónico del Tx cardíaco se manifiesta particularmente por el desarrollo de la enfermedad coronaria, la cual la mayoría de las veces es diferente a la enfermedad coronaria convencional siendo, como se ha señalado, la principal causa de muerte tardía y reTx en los receptores de corazón. Este proceso es exclusivamente limitado al injerto, incluye estructuras venosas, y su progresión puede ser mucho más rápida que la enfermedad ateroesclerótica común. Los elementos que parecen influenciar la aparición de este evento serían aloantígenos dependientes e independientes. En todo caso, existe evidencia experimental tangible para sostener una base inmune, como es por ejemplo, la correlación que se ha observado en la presencia de anticuerpos (Ac) antiendoteliales y Ac anti-HLA producidos por receptores (2).

Aunque las drogas inmunosupresoras de uso habitual son efectivas en la reducción de la incidencia de rechazo agudo durante los primeros meses post Tx, parecen ser menos efectivas en prevenir la pérdida crónica del injerto y en ese aspecto como se sabe, la vasculopatía del injerto cardíaco es el principal factor que limita la sobrevida a largo plazo en los receptores (3).

De allí que surja la opción de ofrecer una estrategia más focalizada y específica que pueda resguardar al corazón transplantado de la respuesta inmunológica sin comprometer al resto del organismo. Dentro de la inmunología del Tx, esto correspondería a la llamada inducción de tolerancia. Operacionalmente tolerancia se podría definir como: insensibilidad inmunológica al antígeno (Ag) donante, pero no ante otro Ag diferente. Como ya se ha señalado, la mayor limitación del Tx de órgano en la actualidad, es la dependencia continua de largos períodos de inmunosupresión ya que en el presente la sobrevida del injerto requiere y depende de un régimen de por vida de múltiples y costosos medicamentos inmunosupresores que introducen potenciales complicaciones al receptor y que provee solo un éxito limitado en la prevención del rechazo crónico.

Todos estos fármacos, si bien son efectivos, tienen el inconveniente de actuar de manera no específica y de allí que el gran desafío terapéutico de la inmunosupresión, es lograr diseñar un esquema que, ocasionando el mínimo de consecuencias en el organismo del donante, sea lo suficientemente potente para evitar el rechazo agudo o crónico sin riesgo de infección o tumor.

¿Qué es Tolerancia?
Tolerancia es el resultado de la interacción de los Ags con los receptores antigénicos de los linfocitos, bajo condiciones en que estos no se activan sino que mueren o pierden su capacidad de respuesta. Esta inactivación de los linfocitos, es específica desde el punto inmunitario e inducida por el Ag, características principales de todas las formas de tolerancia.

¿Cuáles son las propiedades generales de la tolerancia inmunitaria?

• La tolerancia es específica a nivel inmunitario, y por lo tanto puede deberse a la eliminación o inactivación de los linfocitos T o B específicos para el Ag. Tanto tolerancia como activación linfocitaria, son inducidas por las interacciones de los Ags con el mismo tipo de receptores: inmunoglobulinas de membrana en las células B o el receptor de las células T restringidas por el MHC (TCR). El que tales interacciones den lugar a tolerancia o activación depende del estadio de maduración de los linfocitos específicos, de la naturaleza del estímulo antigénico y de la naturaleza (para las células T) de las células presentadoras de Ag (APC).
• Los linfocitos inmaduros o en desarrollo son más susceptibles a la inducción de tolerancia que las células maduras competentes. Es la llamada “tolerancia central”. Un experimento clásico de la década del 50 (Sir Peter Medawar), ilustra esta situación: A una cepa de ratas a se le inyectó células linfoides de una cepa b; en la etapa adulta, a estas ratas se les realizó injertos de piel de la misma cepa b y de una tercera: c. Se observó que mientras que el injerto de la cepa b fue aceptado el de la cepa c fue rechazado, es decir, hubo aceptación y tolerancia específica para una cepa y rechazo de un tercer participante
• La tolerancia frente a Ag extraño se induce incluso en linfocitos maduros cuando estas células se exponen a los mismos, bajo condiciones particulares. A la tolerancia inducida en linfocitos maduros que se encuentran en tejidos periféricos se llama “tolerancia periférica”.(Fig.1).

La tolerancia inmunitaria es el resultado de dos posibles consecuencias de su encuentro con el Ag: la eliminación clonal o muerte celular y la anergia clonal o inactivación funcional (sin muerte) (4).

Tolerancia en transplante cardíaco
Han sido tres las estrategias principales involucradas en la inducción experimental de tolerancia en transplante:

• Bloqueo coestimulatorio.
• Quimerismo
• Depleción linfocitaria

Veremos a continuación, que experiencia existe respecto del Tx Cardíaco en particular.

Bloqueo coestimulatorio
Como es sabido, en la respuesta inmunológica del Tx, el Ag es presentado por APC restringido por su MHC siendo reconocido por el TCR del linfocito T. Sin embargo hace algunos años Lafferty y Cunningham sugirieron que este solo reconocimiento no era suficiente para activar la célula T y nació el concepto de segunda señal o vía coestimulatoria: la vía B7-CD28. . De allí surgen dos corolarios: 1°: Una 2ª señal liberada sin Ag reconocido es un evento neutral para las células T. 2°: Si una célula T enfrenta un Ag restringido por MHC pero no recibe la 2ª señal al momento de la reacción antigénica, la célula puede morir o ser resistente a futuros enfrentamientos con el Ag. Este 2° corolario sugiere una interesante manera de prevenir una respuesta inmune después de un Tx, ya que un agente que interrumpa específicamente al receptor coestimulador de células T, podría inactivar solamente a las células T Ag-específicas, dejando inalteradas las otras células T. Existen además otras vías coestimulatorias como: CD40-CD154, que también ha sido utilizada en modelos de tolerancia.

Por otra parte, se ha evidenciado la existencia de un receptor diferente del CD28: el CTLA4 y que tiene más bien una función de contrarreceptor, pues su unión a B7 resulta en inactivación de la célula T. Esta molécula, que puede obtenerse en forma quimérica a través de técnicas de biología molecular e inmunoglobulinas de cadena pesada (CTLA4-Ig), ha sido utilizada en modelos experimentales (Fig. 2)(5).

Bloqueo de la vía coestimulatoria CD28-B7 utilizando CTLA4
El interés en la señal de receptores coestimuladores se incrementó cuando Lenschow demostró que el bloqueo del receptor coestimulatorio podía prevenir específicamente el rechazo en ratas. En estas se indujo diabetes administrando una toxina a células pancreáticas beta y transplantando luego a la rata islotes pancreáticos humanos La rata curó su diabetes pero los islotes fueron rechazados a los pocos días regresando la diabetes. Lenschow demostró que la administración de CTLA4-Ig, dos semanas después del Tx, lograba que la función del injerto se mantuviera por largo tiempo con una sobrevida libre de diabetes. Si se inyectaban islotes en el riñón contralateral y se removían quirúrgicamente los primeros, se mantenía libre de diabetes siempre y cuando estos islotes pertenecieran al mismo donante humano original, ya que islotes cultivados de otro humano eran rechazados porque el sistema inmunitario de la rata había aprendido a reconocer tejidos del donante humano original respondiendo normalmente contra células similares de otro donante humano lográndose por lo tanto, tolerancia específica inducida (6).
La terapia con CTLA4-Ig al momento del Tx también ha demostrado prolongar la sobrevida del injerto cardíaco en modelos de roedores (7,8). Otro estudio en ratas mostró en exámenes realizados 7 días post Tx cardíaco, que todos los corazones transplantados de ratas tratadas y no con CTLA4-Ig, tenían infiltrados celulares mononucleares en los injertos, sin embargo, el fenotipo de la citoquina de la célula infiltrante era diferente. En el grupo control (rechazo), la respuesta inmune dentro del injerto se caracterizaba por expresión de citoquinas de linfocitos T helper 1 (Th1), mientras que en el grupo tratado con CTLA4-Ig (tolerante) lo era con citoquinas producidas por linfocitos helper 2 (Th2) (9). El mecanismo invocado para explicar este fenómeno se basa en el llamado paradigma de la activación del linfocito helper (Th1/Th2), y que ha sido bien estudiado en el contexto de tolerancia en Tx, ya que hay evidencia que sostiene la hipótesis que las células Th2 promueven la inducción de insensibilidad y que se encuentran presentes en receptores tolerantes. Basado en estas experiencias es que se sostiene que en general Th1 sería responsable del rechazo y Th2 de tolerancia, lo que explicaría el efecto que se produce al bloquear la vía coestimulatoria con CTLA4-Ig (3).

La vía CD40-CD154
Diversos estudios han analizado si al bloquear específicamente esta vía se induce tolerancia y se previene la vasculopatía del injerto. En un modelo de ratas deficientes de la vía CD40, se realizaron Tx cardíacos y se compararon con grupos controles. Se observó que hubo tolerancia específica en los receptores deficitarios con aceptación de injertos de piel del donante y rechazo de terceros. Sin embargo se constató que a las 8 – 12 semanas post Tx, había un fenómeno ateroesclerótico significativo. Se concluyó finalmente que el bloqueo de esta vía induce tolerancia aloespecífica pero no previene vasculopatía (10). Otro trabajo también en ratas, estudió el efecto de Ac antiCD154 en animales sometidos a Tx cardíaco y de aorta abdominal; se observó que si bien se obtuvo tolerancia, también hubo una proliferación intimal significativa tanto en corazón como en aorta (11).

A fin de analizar en forma conjunta el rol de ambas vías coestimulatorias señaladas (CD154-CD40 v/s CD28-B7) en la regulación de la respuesta alogénica de Th1 y Th2 en vivo, se realizó recientemente un estudio en dos grupos de ratas: Utilizando técnicas de gen knockout se logró diseñar modelos de ratas deficitarias, demostrándose que STAT4 knockout altera la generación de respuesta Th1 mientras que STAT6 knockout afecta respuesta normal Th2. De allí que este gen knockout pueda ser usado para estudiar el rol de la respuesta Th1 y Th2 en rechazo e inducción de tolerancia. Usando ratas STAT4 y STAT6 como receptores de aloinjertos cardíacos se estudió el rol de las vías coestimulatorias de las células T, al utilizar CTLA4-Ig para bloquear CD28-B7 y Ac anti CD154 para bloquear CD154-CD40. Se practicó Tx cardíaco en tres grupos: STAT4, STAT6 y ratas normales; a unas se les bloqueó con CTLA4-Ig y a otras con anti CD154. Se observó que al utilizar CTLA4-Ig hubo tolerancia en los 3 grupos mientras que con anti CD154 sólo hubo tolerancia en aquellas ratas deficitarias en la respuesta Th1. En conclusión: estos datos sugieren que mientras el bloqueo CD28-B7 es efectivo en inhibir la respuesta aloinmune tantoTh1 como Th2 y promover tolerancia in vivo, el bloqueo CD154-CD40 es cuantitativamente menos efectivo en un medio predominantemente Th1 (12). Esto podría tener implicancia en la comprensión de los mecanismos inmunológicos de rechazo y tolerancia y en el desarrollo de futuras estrategias inmunoterapéuticas para el transplante.

Quimerismo
Quimerismo puede ser definido como: coexistencia de células de individuos genéticamente diferentes. El reconocimiento de que el quimerismo de médula ósea está asociado con tolerancia inmunológica tiene al menos medio siglo de antigüedad. Billinghamm observó en vacunos adultos que eran gemelos univitelinos con una placenta común durante su vida intrauterina y que poseían quimerismo eritrocítico, que eran capaces de aceptar injertos de piel indistintamente uno de otro (13). Otros investigadores fueron capaces de duplicar esta observación en modelos experimentales por inoculación de células hematopoyéticas obtenidas de donantes MHC dispares en fetos de ratas (14).

Una forma de inducir quimerismo es el llamado quimerismo mixto, método que pretende “engañar” al sistema inmune del receptor para que trate a los Ags donantes como si fueran propios. Para ello se requiere que el huésped sea preacondicionado con una amplia depleción linfocítica la que se obtiene generalmente con irradiación linfoide total y uso de Ac antilinfocíticos y antitimocíticos para hacer espacio e infundir luego una transfusión de médula ósea del donante para que haya coexistencia celular que permita que en el timo, las células auto-reactivas y donante-reactivas, sean eliminadas mediante selección negativa (tolerancia central delecional).

El establecimiento de quimerismo mixto como estrategia de inducción de tolerancia para un donante aloantigénico, requiere de establecer un multilineamiento de quimerismo hematopoyético de células de médula ósea entre donante y receptor antes del Tx. Los datos reportados por Kawuai et al, han demostrado que usando esta estrategia la tolerancia a aloantígeno puede ser inducida en animales. El protocolo descrito para esta preparación (para riñones en modelos de monos, pero aplicable a corazón), es compleja e involucra, como se señalara anteriormente, una amplia irradiación corporal y tímica así como terapia inmunosupresora, infundiendo la médula ósea donante al receptor en el momento del Tx. Sykes y Sachs demostraron que se podía no solamente obtener una larga sobrevida de injertos en ausencia de cualquier forma de inmunosupresión, sino que también los monos fueron específicamente tolerantes a los aloantígenos del donante, aceptando injertos de piel de éste pero no de un tercero (3).

Experiencia con quimerismo mixto en Tx cardíaco
Un trabajo presentado por Kawaharada, plantea la prevención de la vasculopatía del aloinjerto por quimerismo mixto hematopoyético. Usando un modelo de Tx aórtico en ratas, fueron preparadas quimeras previa irradiación y sin utilizar inmunosupresión. Se prepararon 4 grupos de animales (6 por grupo): un grupo de control singénico, un grupo de contro alogénico, un grupo estudio (ratas quimeras mixtas a las que se les transplantó médula ósea de ratas donantes) y un grupo control de ratas quimeras mixtas a las cuales se les realizó Tx de un tercer participante que no tenía relación con la médula ósea infundida. Se observó que no hubo ninguna diferencia entre el grupo control singénico y el grupo de ratas quimeras mixtas en el grado de hiperplasia, apreciándose conservación total de la arquitectura del vaso, mientras que en los otros grupos se observaba hiperplasia de la íntima, fibrosis, disminución de la túnica media y un patrón que demostraba una respuesta inmunológica más o menos severa. Se concluyó que el quimerismo mixto es una alternativa factible para prevenir la vasculopatía del injerto y puede ser una promesa en el Tx clínico (15).
Otro estudio reciente sobre quimerismo mixto, rescata varios aspectos interesantes: en primer lugar utiliza animales más grandes (cerdo miniatura en vez de ratas); en segundo lugar la depleción de células T no se consigue por irradiación corporal total la que generalmente es letal, sino que utiliza una inmunotoxina antiCD3 del cerdo; y en tercer lugar, en vez de usar médula ósea del donante utiliza sangre periférica con altas dosis de células madres obteniéndose de esta manera un nuevo repertorio de células quimeras mixtas. Cinco a 12 meses después de ser inducido quimerismo, se transplantaron corazones de los donantes originales de las células, en los cerdos quimeras mixtas. Resultados: Los corazones transplantados en los cerdos no tratados fueron rechazados dentro de 44 días. En los quimeras mixtas, tuvieron aceptación a largo plazo (153 a 362 días) sin inmunosupresión y con mínimo desarrollo de vasculopatía.

El interés de este reporte radica en que por primera vez se establece exitosamente quimerismo mixto, al inducir tolerancia donante-específica en aloinjertos cardíacos de animales grandes, usando un método no mieloablasivo y relativamente no tóxico. Por otra parte, cabe señalar que aunque el quimerismo mixto ha sido demostrado en roedores (modelo más utilizado), existen diferencias inmunobiológicas de éstos con animales más grandes al igual que con los humanos, puesto que los roedores no expresan Ag MHC II en el endotelio de sus arterias coronarias. Estos autores al igual que otros, demuestran que la inducción de tolerancia puede mitigar el desarrollo de vasculopatía coronaria (16). Actualmente se investiga la posibilidad de que el bloqueo coestimulatorio pueda remplazar la depleción de células T para activar altos niveles de quimerismo y tolerancia central en modelos de cerdo. Estos protocolos no mieloablasivos podrían ser útiles en tolerancia a largo plazo en humanos tanto para aloinjertos como xenoinjertos.

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