Resumen

Introducción
En esta conferencia se describen tres mecanismos de progresión de la enfermedad renal que son aplicables a la nefropatía crónica del injerto, y que han sido estudiados extensamente por nuestro grupo: la proteinuria, los factores de transcripción y algunos aspectos de la angiotensina II.

Frente a una enfermedad renal progresiva, actualmente es posible hacer intervenciones terapéuticas en cuatro aspectos: la proteinuria, la hiperlipidemia, la hipertensión arterial sistémica y la hiperfiltración glomerular.

Rol de la proteinuria
La proteinuria tiene un rol patogénico en la enfermedad renal, como lo demuestra el hecho de que los enfermos portadores de nefropatías crónicas no diabéticas que tienen mayor proteinuria, expresada como proteína total o como un cuociente entre proteinuria y creatinina, presentan un declive más significativo de la función renal. Previamente se había observado, en estudios experimentales en animales, que a medida que aumentaban los niveles de proteinuria aparecían trastornos a nivel tubular, dilatación tubular y compromiso intersticial.

Rol de los factores de transcripción
En un estudio realizado por nuestro grupo en casos de glomerulopatías membranosas progresivas, comparadas con un grupo de enfermedades no progresivas, se observó que los pacientes con enfermedades progresivas presentaban una proteinuria mucho mayor que aquéllos con enfermedad no progresiva, definiendo proteinuria como una carga proteica sobre 8 gr/día por sobre seis meses. Además, los pacientes con nefropatía progresiva presentaban mayor compromiso de la función renal, mayor presión arterial media y mayor compromiso túbulointersticial.

Se muestra la biopsia de un paciente con enfermedad progresiva, en la que todavía hay glomérulos que no están esclerosados, pero existe dilatación tubular, algún grado de fibrosis e infiltrado inflamatorio.

En estos casos se estudió la expresión de algunas chemoquinas mediante técnicas de hibridación in situ, que detectan la expresión del mensajero, y mediante técnicas de inmunohistoquímica, que detectan la presencia de las proteínas. Las chemoquinas son un grupo de citoquinas proinflamatorias, algunas de las cuales podrían expresarse a nivel tubular en relación a la proteinuria. Se encontró que en los portadores de enfermedad progresiva había una sobreexpresión, tanto del Monocyte Chemotactic Peptide-1 (MCP-1), una de las principales chemoquinas responsables de la quimiotaxis de monocitos y macrófagos, como de RANTES y de Osteopontina (OPN), en comparación con los portadores de la forma no progresiva.

También se estudió la expresión de algunas citoquinas profibrogénicas, como el factor de crecimiento ligado a las plaquetas (PDGF), el Transforming Growth Factor (TGF-beta) y la Smooth Muscle alfa actina alfa (actina del músculo liso, alfa SMA). Nuevamente, en las formas progresivas se observó una up regulation del mensajero del TGF-beta , fundamentalmente a nivel de los túbulos proximales, en relación a las glomerulopatías no progresivas, en la que también se detecta el mensajero, pero no de forma tan intensa.

La expresión de alfa SMA también era mucho mayor, fundamentalmente a nivel intersticial, y no tanto a nivel glomerular. También se demostró una sobreactivación de las chemoquinas MCP-1, RANTES y OPN en la enfermedad progresiva, y un nivel significativamente más elevado de las citoquinas profibrogénicas PDGF, TGF-beta y alfa SMA.

La alfa SMA es un marcador de la pared arteriolar, fundamentalmente de arteriola aferente, que en casos de nefropatía membranosa se expresa a nivel de las células mesangiales cuando hay una activación de éstas. Normalmente está presente a nivel de intersticio en una forma muy tenue, y su expresión aumentada se correlaciona con la progresión de la enfermedad. La expresión de alfa SMA a nivel de los fibroblastos aumenta cuando éstos se activan, fundamentalmente a nivel del intersticio, por lo tanto, la expresión de alfa SMA denota presencia de fibroblastos activados a nivel del intersticio renal.

No queda claro de dónde provienen los fibroblastos; algunos dicen que vienen de la sangre, otros dicen que de una diferenciación de células tubulares, pero lo importante es que infiltran todo el intersticio, produciendo colágeno y la correspondiente fibrosis. Células tubulares estimuladas por TGF-beta y PDGF aumentan la expresión de alfa SMA.

Analizando la correlación entre la expresión de alfa SMA y la expresión de TGF-beta y PDGF en un caso de nefropatía membranosa proliferativa, se encontró una muy buena correlación, mediante un análisis computacional de imágenes que medía la expresión de PDGF a nivel de las células tubulares y de alfa SMA a nivel del intersticio renal. Por lo tanto, existe una buena correlación entre PDGF y presencia de células positivas para alfa SMA. Lo mismo se observó para TGF-beta , pero no para PDGF a nivel tubular proximal, y para la presencia de alfa SMA a nivel del intersticio renal.

Finalmente, otro aspecto muy importante es el infiltrado celular inflamatorio, que se creía que era de tipo monocítico-macrofágico. Estudiando la naturaleza del infiltrado celular en la enfermedad renal progresiva tipo nefropatía membranosa, mediante marcadores celulares en cortes en hielo y parafina, se encontró que las células son fundamentalmente linfocitos CD4, y en menor proporción linfocitos CD8; también hay algunas células de tipo monocito-macrófago, detectados con el marcador CD68. Evidentemente que este aumento del infiltrado celular es mucho mayor en la enfermedad progresiva, que por naturaleza debe tener infiltrado inflamatorio.

Todos estos elementos confirman la hipótesis, sugerida en modelos experimentales, de la importancia en la patología humana de la sobrecarga proteica a nivel tubular (no se sabe si es sólo la albúmina o también la transferrina y algunas lipoproteínas), que activa las células tubulares e induce en ellas la producción de chemoquinas como MCP-1, RANTES y OPT, y de algunas citoquinas profibrogénicas como PDGF y TGF-beta. Estos factores van a actuar fundamentalmente sobre algunos fibroblastos o sobre células tubulares que se diferencian a fibroblastos, y cuando hay fibroblastos activados se reconocen por la expresión de alfa SMA. Estos monocitos-macrófagos y linfocitos infiltran el intersticio, al que llegan atraídos por la acción de las chemoquinas.

Los factores de transcripción son necesarios para la transcripción de los genes de citoquinas proinflamatorias y factores profibrogénicos, y por lo tanto, son indispensables para la expresión de éstas. Entre los más estudiados están el Nuclear Factor kappa B (NF kappaB) y la Proteína Activadora 1 (AP-1), y es lógico suponer que lo que ocurre con estos marcadores de transcripción en algunos tipos de enfermedades progresivas es aplicable a lo que sucede en la nefropatía crónica del injerto, cuando se comporta como una enfermedad progresiva.

El NF kappaB es un dímero compuesto por dos subunidades, p50 y p65, unido a una proteína inhibitoria denominada I kappaB. Hay muchas señales que activan a estos factores de transcripción; cuando esto ocurre entra en acción una kinasa que fosforila a esta proteína inhibitoria dejando libre el dímero p50-p65, que de esta forma entra al núcleo, donde activa a los genes proinflamatorios o profibrogénicos. La activación de estos genes induce la formación de ARNm y desencadena la síntesis de proteínas inflamatorias. Para estudiar estos factores de transcripción se requiere analizar la expresión de NF kappaB activado, que necesariamente debe ser detectado dentro del núcleo.

Estudios experimentales previos demostraron que las células tubulares en cultivo aumentaban la expresión de NF kappaB a los 15-30 minutos de ser estimuladas con seroalbúmina bovina. Otro modelo experimental de ratas sobrecargadas con albúmina, que también producen proteinurias masivas en relación con controles, demostró una activación de NF kappaB a nivel de las células tubulares proximales.

Nuestro grupo estudió pacientes con lesiones glomerulares mínimas con un cuadro clínico caracterizado por intensa proteinuria, función renal normal y normotensión, en los cuales se midió la expresión de NF kappaB con un sistema de análisis de imagen que permite tener un score de tinción de NF kappaB; este grupo de pacientes con lesión glomerular mínima se utilizó como control porque la enfermedad no era progresiva. El estudio se enfocó en un grupo de pacientes con nefropatía membranosa, que se dividió en un subgrupo con nefropatía membranosa progresiva y un subgrupo con nefropatía membranosa no progresiva. La proteinuria promedio era de 11 gr, mientras que en el grupo con nefropatía no progresiva, era de 5-6 gr. La diferencia principal era que los que tenían enfermedad progresiva presentaban algún grado de compromiso de la función renal, o sea, tenían algún grado de compromiso túbulointersticial. Se analizó la expresión de NF kappaB mediante el sistema de análisis computacional, y se encontró una mayor expresión de este factor en las formas progresivas que en las no progresivas.

En otro estudio se midió la expresión de NF kappaB mediante la técnica Southwestern, para lo cual se utilizaron oligonucleótidos correspondientes a la secuencia de DNA de consenso a la que se une el dímero p50-p65 cuando se activa y migra al núcleo (Kidney Int 1999 Jan; 55(1):209-14). Conociendo la secuencia de consenso de DNA, se le marca con digoxigenina para detectar el NF kappaB cuando está dentro del núcleo celular. Por lo tanto, con esta técnica se detectan núcleos celulares activados que tienen la tinción dentro de ellos, a diferencia de la inmunohistoquímica, que detecta estos factores a nivel plasmático, sin diferenciar si están activados o no. Lo mismo se puede hacer para AP-1, del cual se detectan las subunidades c-fos y c-jun.

Otro estudio analizó diferentes glomerulopatías tomando como grupo control siete pacientes con nefropatía por IgA no proteinúrica. En la lesión glomerular mínima existe una mucho mayor activación de NF kappaB que en la glomerulopatía membranosa y que en la nefropatía por IgA no proteinúrica, con relación al grupo control normal; las diferencias son significativas, por lo que se concluye que en grupos con nefropatías proteinúricas, lesión glomerular mínima y nefropatía membranosa existe una marcada sobreactivación del factor de transcripción NF kappaB.

Algo parecido se observó para AP-1, factor de transcripción que participa en la activación de genes proinflamatorios o profibrogénicos. Evidentemente el score de tinción fue levemente menor (10.000 v/s 30.000 para NF kappaB), pero se detectó una intensa activación a nivel de lesión glomerular mínima en comparación con los pacientes con nefropatía membranosa. En general los pacientes con glomerulopatías proteinúricas mostraron una sobreactivación significativamente mayor que los enfermos con IgA no proteinúrica o los del grupo control.

Se muestra un caso de lesión glomerular mínima en el que se reconoce la activación por la presencia de células tubulares con núcleos intensamente demarcados. En otro caso se ve un glomérulo que contiene núcleos de células podocitarias activadas, lo que no es sorprendente, y se visualiza a nivel de células tubulares proximales. Sin embargo, cuando se estudia la expresión de la citokina proinflamatoria OPT (Osteopontina) o la presencia de MCP-1, se observa que no hay traducción de la señal; en otras palabras, hay activación de los factores de transcripción, pero no hay expresión del gen, lo que es esperable en una nefropatía no progresiva como la lesión glomerular mínima.

En pacientes con nefropatía por lesión mínima, AP-1 aparece con más o menos el mismo patrón de distribución que NF kappaB: p50 se ve por inmunohistoquímica, fundamentalmente a nivel de las células tubulares, pero no se detecta si está activado o no, ya que se tiñe citoplasma y núcleo, mientras que OPT es negativo; se muestra una doble tinción correspondiente a una hibridación in situ, que permite detectar el mensajero, y a un Southwestern, que permite detectar el NF kappaB. Se observa que sólo hay NF kappaB a nivel del núcleo, mientras que el citoplasma prácticamente no está teñido, lo que es lógico porque no hay activación génica en el caso de la lesión mínima.

Un hallazgo importante es la correlación observada (r = 0,64) entre la magnitud de la proteinuria en pacientes con lesión glomerular mínima y la activación de NF kappaB. En cambio, no existe correlación significativa entre NF kappaB y AP-1; o sea, en la lesión glomerular mínima hay una sobreactivación de ambos factores, pero no hay correlación entre la activación entre ambos en una misma biopsia, lo que podría indicar que las células que están activadas y que están activando a los factores de transcripción, no son las mismas.

En la nefropatía membranosa también se detecta activación de NF kappaB a nivel tubular, pero la diferencia es que hay una activación génica de OPT y de MCP-1, que se detecta por inmunohistoquímica a nivel de células tubulares.

Se muestra un caso de nefropatía membranosa progresiva, en el cual hay activación de algunos podocitos, pero la activación ocurre fundamentalmente a nivel de las células tubulares; los núcleos azules demuestran la presencia de los factores de transcripción p50 y AP-1 activados, además de OPT y el mensajero para MCP-1 en algunas células tubulares.

También existe correlación entre la proteinuria y la activación de NF kappaB en la nefropatía membranosa, pero además hay una muy buena correlación entre ambos factores de transcripción (NF kappaB y AP-1), a diferencia de lo observado en la lesión glomerular mínima. Se planteó que esto podría deberse a que las subunidades de estos factores de transcripción (p50 y p65 para NF kappaB, c-fos y c-jun para AP-1) podrían ser heterodímeros diferentes, pero al analizarlos mediante inmunohistoquímica no se encontró una diferencia significativa, descartándose que la diferente activación génica se deba a constituyentes proteicos diferentes de estos factores de transcripción.

En la nefropatía por IgA se encuentran escasas células activadas, a diferencia del control positivo que corresponde a una lesión mínima y de una nefropatía membranosa progresiva, la que tiene doble tinción: por un lado están los núcleos de las células tubulares teñidos para NF kappaB demostrando que está activado, y por otro lado está el citoplasma rojo por una hibridación in situ que detecta el mensajero para MCP-1. La misma célula en la cual está activado el núcleo estaría transcribiendo el mensajero de la chemoquina proinflamatoria MCP-1.

Por lo tanto, sólo en el caso de la nefropatía membranosa se ha encontrado un mecanismo que explica cómo la proteinuria activa factores de transcripción de genes proinflamatorios y profibrogénicos, aunque no está claro por qué no lo hace en la lesión glomerular mínima. Este trabajo, que será presentado en el Congreso Americano de Nefrología en los próximos días, postula que esto se debe a que en la nefropatía membranosa existe una activación significativa de ambos factores de transcripción.

Otra explicación posible es el tiempo de activación que requieren los factores de transcripción; en la lesión glomerular mínima hay una proteinuria transitoria o de corta evolución, mientras que en la glomerulopatía membranosa los pacientes tienen proteinurias crónicas de larga data. El tiempo de exposición a la proteinuria podría explicar esta diferente activación.

Por otra parte, la célula tubular responde a la proteinuria con un daño celular similar al causado por un estímulo químico, que podría ser la primera señal, requiriéndose una señal adicional para la transcripción génica, pero esto aún es especulativo.

Lo que está claramente demostrado es que el NF kappaB, como factor de transcripción, tiene una serie de otros inductores además de las citokinas y factores de crecimiento, tales como estímulos inmunológicos y la proteinuria. Las lipoproteínas, especialmente el LDL oxidado, tienen una acción oxidante. El factor de crecimiento derivado del endotelio también puede activar al NF kappaB, al igual que el factor que aumenta la permeabilidad endotelial, como se ha descrito en las esclerosis focales y en la lesión mínima.

También hay inhibidores del NF kappaB, como los glucocorticoides que son el inhibidor natural, la ciclosporina, la estatina, la rapamicina y los antioxidantes. Esto es muy importante para el desarrollo de intervenciones terapéuticas destinadas a inhibir la activación de este factor de transcripción.

Rol de la angiotensina II (ATII)
La ATII, además de sus efectos hemodinámicos a través del receptor AT1, tiene una serie de efectos no hemodinámicos, entre los cuales se encuentra el ser un poderoso estimulante del TGFb, con lo que aumenta la producción de matriz extracelular.

Actualmente, se sabe que la ATII estimula al TGFb y al factor de crecimiento del tejido conectivo (Connective Tissue Growth Factor), un poderoso factor de crecimiento que al igual que MCP-1 tiene propiedades profibrogénicas. Su estimulación por AT II promueve un mayor aumento de la matriz extracelular.

Estudios recientes demuestran que la ATII activa al NF kappaB a través de los receptores AT1 y AT2 de las células musculares lisas vasculares (Kidney Int 1997; 52(6):1497-510). Además de los otros inductores mencionados, la AT II per se es capaz de estimular la activación de NF kappaB y por ende, puede estimular la transcripción de algunos genes proinflamatorios o profibrogénicos. Este es uno de los principales mecanismos de acción de la ATII.

En un modelo experimental de ratas sometidas a sobrecarga proteica, el grupo de Jesús Egido demostró que a nivel del túbulo existe un aumento de la expresión de la ECA y de angiotensinógeno, lo cual conlleva a un aumento en la síntesis de AT local (Hypertension 1999 Feb; 33(2):732-9). Esto permite plantear la existencia de un mecanismo de autoperpetuación del daño glomerular: una vez que se inicia la proteinuria, ésta promovería en algunos casos la síntesis de AT local y por otro lado, la ATII estimularía directamente a los factores de transcripción a través de los receptores AT1 y AT2. Este mecanismo podría perpetuar un daño crónico a través de la activación de ATII en animales proteinúricos, incluso después de que cese la proteinuria.

En un modelo de ateroesclerosis en conejos se demostró que los IECA impiden la activación de NF kappaB, la expresión de la citokina proinflamatoria MCP-1 y la infiltración macrofágica, lo cual también avala la participación de la angiotensina. Los animales tratados con quinapril tienen claramente menor lesión, menor expresión de MCP-1 y menor infiltración macrofágica, asociada a una mucho menor actividad de NF kappaB (Am J Pathol 1998 Dec;153(6):1825-37).

Otro estudio publicado en 1997 también demostró que el enalapril disminuye la activación de NF kappaB en un modelo experimental de obstrucción ureteral, la que produce una gran infiltración celular y activación de este factor de transcripción, que se reduce significativamente en animales tratados con enalapril (Kidney Int 1997; 52(4):926-33).

Todo esto avala el rol de la ATII como mecanismo de progresión de la enfermedad renal, al promover la activación de TGFbeta y el aumento de la matriz extracelular.