Aspectos moleculares en el cáncer colorrectal

Timidilato sintetasa
Todos los tratamientos contra el cáncer tienen blancos (target); algunos son ubicuos y algunos son altamente específicos. Las terapias más eficaces serán aquéllas con blancos específicos, expresadas diferencialmente en tejidos cancerosos versus tejidos normales, los cuáles son responsables del control con niveles de los agentes terapéuticos en rangos de tolerabilidad realizables.

La primera terapia contra el cáncer, diseñada específicamente contra un blanco fue el antimetabolito fluoropyrimidine (FP), fluorouracil (5-FU), la droga más usada y más estudiada en el cáncer colorrectal. El target molecular del 5-FU, que define una de las formas de su actividad citotóxica es la timidilato sintetasa (TS), enzima que cataliza el paso de uridina a timidina en la síntesis del DNA. No siendo una sorpresa que éste haya sido uno de los primeros targets moleculares estudiados en el cáncer colorrectal.

La actividad catalítica de la TS fue evaluada en biopsias de muestras de cáncer colorrectal tratados y no tratados y en metástasis, así como en mucosa normal, observándose mayores niveles y mayor variación de la actividad en el tumor que en el tejido normal. Después de la administración de 5-FU, se vio que la actividad de la TS varió durante todo el período de exposición al 5-FU, la co-administración de leucovorina resultó en menores niveles de actividad de la TS, y menor actividad residual (8,9).

Investigaciones en la University of Southern California (USC), usando reacción de polimerasa en cadena (PCR), analizaron la expresión de TS en biopsias de metástasis de cáncer colorrectal, correlacionando los resultados con la respuesta a la infusión de 5-FU como tratamiento. La respuesta fue inversamente significativa a los niveles de TS, siendo mayor de 50% para la cohorte con menores niveles de TS, y menor de 5% en aquélla con altos niveles de TS. En esta última la expresión de TS se correlacionó en forma inversa con la sobrevida (10).

Durante el mismo período, el Instituto Nacional del Cáncer en Estados Unidos, desarrolló un anticuerpo monoclonal contra TS (TS 106), el cual era específico y se correlacionaba con la expresión de proteínas, la unión de ligandos y la resistencia de líneas celulares en carcinoma de colon de humanos (11,12). La primera correlación clínica se hizo en relación a pronóstico y respuesta a la quimioterapia adyuvante en cáncer rectal, un estudio retrospectivo, en el cual se observó que una baja expresión de TS se correlacionaba estadísticamente con una mejor sobrevida, y que niveles altos de expresión de TS se correlacionaban con beneficio de la quimioterapia (13).

Aunque del punto de vista pronóstico la expresión de TS intratumoral se correlaciona repetidamente con la sobrevida a través de la etapificación y el tratamiento, la expresión de TS medida por inmunohistoquímica (IHC) en el tumor primario no es un predictor confiable de respuesta a la terapia con FP en la subsecuente enfermedad metastásica (14-16). Efectivamente, se ha demostrado que los niveles de TS de las metástasis difieren no sólo de los vistos en el sitio del tumor primario sino también entre los sitios de metástasis (17). Cuando se ha analizado retrospectivamente depósitos tumorales metastásico midiendo TS por IHC, se ha identificado correlación con la respuesta a la terapia (18-20).

Definiendo los niveles de expresión de TS (altos o bajos) en población con cáncer colorrectal tratada, puede demostrarse un mayor rango de respuesta al 5-FU. Aunque la predicción de resistencia a FP en el grupo con TS alta es absoluta, no todos los pacientes con baja TS disfrutan del beneficio de responder a la terapia. Aún considerando la TS como el blanco, otros genes interactúan en la determinación de la respuesta al 5-FU (involucrados en las vías anabólicas y catabólicas de éste).

Timidina fosforilasa
La timidina fosforilasa (TP) cataliza la fosforilación reversible de timidina a timina, promoviendo la transformación de drogas antimetabolito pirimidina a metabolitos citotóxicos activos, habiéndose demostrado la correlación entre la deficiencia celular de esta enzima y la resistencia relativa al 5-FU (21,22). Como los niveles de TP generalmente se han encontrado más altos en las células del tumor que en los tejidos normales, una citotoxicidad específica potencial puede ser mediada por esta enzima (23). También se ha identificado a la TP como idéntica al factor de crecimiento endotelial derivado de las plaquetas; las funciones enzimáticas que promueven la angiogénesis y la motilidad celular son funciones necesarias para el crecimiento y progresión de la malignidad (24). Cantidades elevadas de TP se han visto asociadas a tumores avanzados, presencia de nódulos e invasión microvascular, todo lo cual se relaciona con un pronóstico desfavorable en una gran variedad de tumores sólidos. Aunque los efectos metabólicos de la TP pueden ser beneficiosos para la respuesta tumoral en la fase de terapia con FP, sus efectos angiogénicos implican que niveles elevados de TP puedan significar un peor pronóstico (25). Como una expresión cuantitativa óptima de TP para incrementar la actividad de FP se desconoce, habría un rango de efectos favorables versus desfavorables de esta enzima.

En un estudio prospectivo que incluyó pacientes con cáncer colorrectal en todas las etapas, se midió la expresión de TS y TP, tanto en forma independiente como combinada, observándose un impacto estadísticamente significativo en sobrevida libre de enfermedad y sobrevida global. Sin embargo, en este estudio, se usaron diversos tratamientos y diferentes metodologías para determinar la expresión de los marcadores moleculares (26).

Dihidropirimidina dehidrogenasa
La actividad de la dihidropirimidina dehidrogenasa (DPD), enzima de la vía catabólica del 5-FU, ha sido medida en varios tejidos y tumores humanos, demostrando alta actividad en el hígado y actividad variable en los tumores (27). Aunque el análisis de DPD en tumores, tejidos normales y células mononucleares de sangre periférica es muy variable (28), se ha visto que el nivel intratumoral de DPD es un codeterminante de respuesta tumoral al tratamiento con FP. Estos hallazgos sugieren que la actividad del tejido tumoral por sí misma debería ser analizada como predictora del impacto terapéutico.

Impacto de TS, TP y DPD
Los datos de TS, TP y DPD están disponibles para 33 pacientes de la cohorte original del estudio de la USC, once de éstos pacientes fueron respondedores, rango de respuesta de 29% con infusión prolongada de 5-FU. Se observó que en aquellos pacientes cuyos tumores expresaban niveles bajos de estos tres parámetros hubo un incremento significativo de la sobrevida comparada con aquellos con altos niveles de expresión de alguno de los tres predictores moleculares (29).

Microsatellite Instability
Desde que se descubrió e identificó a la no poliposis hereditaria como mecanismo genético del cáncer de colon, se ha escudriñado el rol de la inestabilidad microsatélite (MSI) en el desarrollo y pronóstico de este cáncer. Análisis recientes de MSI en conjunto con otros biomarcadores, han llegado a definir a los cánceres de colon derecho e izquierdo, y a los cánceres de recto como enfermedades con distintos perfiles genético-moleculares y con diferente comportamiento. En suma, a la aceptada asociación entre mejor pronóstico y cáncer de colon con MSI positiva, reportes recientes de análisis retrospectivos sugieren que el beneficio de la quimioterapia adyuvante podría ser predecido, sobre la base del estado de la MSI del tumor. Los mayores beneficios de la quimioterapia adyuvante basada en FP se agrupan en aquellos cáncer MSI-positiva, mujeres, y aquellos tumores del lado derecho (ambos asociados frecuentemente con MSI-positiva) (30, 31).

Aunque modelos preclínicos han demostrado resistencia a la quimioterapia (para algunos agentes) en cánceres MSI-positiva, pocos datos clínicos han emergido aún como para que estas observaciones puedan ser extendidas como predictoras de respuesta para enfermedad diseminada.

En un análisis retrospectivo de múltiples factores pronósticos moleculares realizado en 72 muestras de biopsia pretratadas de cáncer de recto, sobre 60% de los tumores MSI-positivos respondieron a la radioterapia en oposición a menos de 40% en los tumores MSI-negativos. Como sería de esperar, el porcentaje de cánceres rectales con fenotipo MSI-positivos fue muy pequeño (8%), así que las diferencias en respuesta no fueron estadísticamente significativas en este número de pacientes (32). El impacto del estado MSI en los resultados del tratamiento podría estar mediado indirectamente a través de la pérdida de heterocigosidad en los sitios de otros genes (ej: p53) que directamente impacten en la respuesta (33).

p53
La mutación puntual del gen supresor de tumor ocurre en aproximadamente el 50% de los carcinomas colorrectales; su significado pronóstico en las malignidades gastrointestinales ha sido sujeto de numerosas investigaciones (34). El impacto de la mutación p53 en inducir apoptosis o ser un punto de control positivo o negativo en la interacción terapéutica es un tópico que aún permanece bajo activa investigación. Existen numerosos reportes contradictorios de su correlación con la quimiosensibilidad y radiosensibilidad (35,36).

Algunas de las discrepancias en estos reportes resultan de las diferencias en la definición de la sobreexpresión de la proteína p53 por inmunohistoquímica o de la definición de los “end points” clínicos. Probablemente, como las investigaciones preclínicas están demostrando, el impacto del estado de la p53 en la respuesta a la quimioterapia o a la radioterapia puede estar equilibrado con el estado de otros genes tales como: p21, h MLH1, Bcl-2/Bax, y MDR1 (37,38).

La relación entre p53 como determinante de la actividad del ciclo celular, TS como enzima del ciclo celular y el blanco para la terapia con FP ha sido de gran interés para los investigadores del cáncer colorrectal. Estudios retrospectivos de cohortes con cáncer de colon diseminado usando metodología de HIC, muestran asociación entre p53 , baja expresión de TS y mayores rangos de respuesta; así como TS elevada, con mutación de p53 y no respuesta (39). En estas cohortes, TS fue un predictor significativo como factor independiente, mientras que la p53 sola no lo fue. Por consiguiente, el estado de la p53 en el tumor y la expresión de TS pueden ser co-regulatorios y tener importancia en forma conjunta en la determinación de futuras estrategias terapéuticas.

Factor de crecimiento endotelial vascular y factor de crecimiento de fibroblastos
La angiogénesis tumoral y sus factores promotores de crecimiento han sido asociados con mayor estadío, compromiso de linfonodos y peor sobrevida. En el cáncer colorrectal se ha demostrado niveles elevados de expresión del factor angiogénico “factor de crecimiento endotelial vascular” (VEGF), los efectos biológicos en que este interviene incluyen: regulación patológica de angiogénesis a través del acrecentamiento de la mitogénesis celular-endotelial, migración y remodelación de la matriz extracelular, e incremento de la permeabilidad vascular. Como una terapia dirigida contra sitios blanco, los anticuerpos anti-VEGF han mostrado tener eficacia independiente tan buena como siendo sumada a la quimioterapia con 5-FU y leucovorina, produciendo un mayor rango de respuesta y mayor tiempo para la progresión de la enfermedad, que con la terapia citotóxica sola, para cáncer colorrectal diseminado (40).

Como con los otros blancos moleculares discutidos acerca de la expresión de VEGF y factor de crecimiento de fibroblastos básico (bBFG), existen otras citokinas angiogénicas, como terapias blanco en relación a otros perfiles de genes intratumorales. Quizás la más importante de éstas es el estado de MSI; un porcentaje significativamente menor de cánceres de colon primarios que son MSI-positivos han mostrado expresión alta de VEGF y bFGF (por HIC) comparado con aquellos que no tienen el fenotipo MSI (41). Aunque el fenotipo MSI se asocia con menor incidencia de mutaciónes p53, y la p53 ha mostrado una downregulation con la expresión de VEGF, ninguna correlación se ha observado entre mutación de p53 y presencia o ausencia de fenotipo MSI. Esto indica una p53 independiente de la vía de la angiogénesis en los tumores MSI-positivos, por lo cual el VEFG por sí mismo puede ser usado como marcador predictivo. Los niveles séricos y plasmáticos de VEFG y bFGF han mostrado correlación con el estadío, progresión de la enfermedad, y respuesta a la quimioterapia, por lo que podrían ser usados como predictores de respuesta a quimioterapia, tan bien como terapias biológicas (42).

En un número de estudios la expresión intratumoral de VEGF se ha correlacionado con la expresión de TP (23,43). Estos hallazgos llevan a potenciales implicancias pronósticas y terapéuticas en la elección del tratamiento para los pacientes. La expresión tumoral de VEGF y TP puede influir en la elección del tratamiento definiendo resistencia potencial, utilización de activación selectiva (ej:capecitabina), o sugiriendo el potencial uso de anticuerpos.

Topoisomerasa I
La actividad citotóxica de CPT 11 (Irinotecan) se correlacionó con altos niveles intracelulares de su enzima blanco, topoisomerasa I (topo-I), así como actividad carboxilesterasa, la cual es requerida para su conversión a metabolito activo, SN-38. Como ésta es una droga activa con extenso uso en el cáncer colorrectal tanto sola como en combinación con 5-FU, entendiendo las bases moleculares para su actividad, resistencia, e interacción con FP, es también importante la selección apropiada de los pacientes, la combinación de drogas, y la minimización de las toxicidades.

Existen extensos datos preclínicos que exploran la relación intercelular de la topo-I con otras expresiones de genes con parámetros de eficacia/resistencia. Se ha desarrollado metodología para medir topo-I en muestras de tumor, con algunos resultados en tumores humanos. Sin embargo, la correlación con el pronóstico no está disponible en estudios clínicos. Las pruebas para evaluar la topo-I intratumoral como predictor de la respuesta a CPT-11 solo o en combinación, en futuros trabajos, incluye el seguimiento de:

• Altos niveles de topo-I (los que varían ampliamente) (44), una alta fracción en fase S (45) y adecuada actividad carboxilasa (46) son necesarios para una óptima actividad de CPT-11 en una variedad de líneas celulares cancerosas humanas.
• Correlación entre la copia del gen topo-I, la expresión de la proteína y la sensibilidad a la droga (44).
• Citotoxicidad puede ser mediada por mecanismos dependientes (44) de p53 o mecanismos independientes
• La sinergia de CPT-11 con 5-FU es secuencia-dependiente (47).

Los niveles de topo-I en muestras del tumor pueden ser detectados por HIC (48) y cuantitativamente por PCR en muestras pequeñas del tumor (49). En las muestras de tejido tumoral examinadas, la expresión de topo-I ha mostrado incremento con el incremento en el estadío del cáncer (46), y alta expresión de topo-I ocurre en un mayor porcentaje en cánceres de colon con estabilidad microsatélite que en aquellos con el fenotipo MSI (50).

La mayoría de los estudios individuales ya citados concuerdan en la necesidad de confirmar sus hallazgos a través de grandes estudios prospectivos. La mayoría de los estudios han sido retrospectivos y han sufrido errores en cuanto a que las muestras de todos los participantes no han estado disponibles para su análisis, en quienes los datos acerca de los resultados son conocido. Los marcadores moleculares para los cuales existen datos para estratificar a los pacientes con cáncer colorrectal son TS y MSI. Además, es común que otros parámetros, listados de genes e interacciones aún por ser definidas necesiten ser incorporadas para llegar a ser promesas predictivas.

En el diseño de trabajos con adecuado poder estadístico para discriminar el impacto de varios genes en el resultado clínico, se requiere incrementar el número de pacientes enrolados. Los trabajos que buscan definir diferencias relativamente pequeñas en los resultados de dos o tres tratamientos en una población no seleccionada, toman muchos años para completar e incrementar el rastreo en cómo preguntas de más interés aparecen en estudios más pequeños y en nuevos descubrimientos preclínicos. Para responder una pregunta acerca de un gen, a la vez de ser capaz de completar adecuadamente el poder de pequeños estudios, se corre el riesgo de reunir lo más importante de los marcadores genético-moleculares para examinarlo fuera de contexto. Recientemente la identificación de blancos y nuevos agentes compite de nuevo por el limitado recurso de pacientes.

Una táctica para vencer las dificultades asociadas con la determinación del rol de múltiples parámetros biológicos-moleculares en una población no seleccionada, es el enriquecimiento en la aproximación. Este método involucra segregar la población de pacientes en los mejores y peores respondedores para un régimen estándar y entonces evaluar sus tumores individuales para un panel de marcadores moleculares con un presumible valor pronóstico o predictivo. De esta forma, los parámetros que han sido evaluados pueden constituir una prioridad para fomentar estudios (51).

Porque el end goal de la terapia llamada molecular es dar un tratamiento a una población donde se espera tener la mayor eficacia, otro acercamiento razonable puede ser una selección menor, de poblaciones prospectivamente definidas con tumores que exhiben parámetros moleculares específicos para evaluar resultados terapéuticos. En cáncer colorrectal, con relativamente pocos agentes activos disponibles, los mejores resultados alcanzados y los perfiles de toxicidad son resultados bien conocidos. Los resultados en mejor respuesta, sobrevida y toxicidad deberían ser fácilmente visibles en pequeños estudios, de un solo brazo. Este modelo permitiría que trabajos subsecuentes incorporaran una selección de parámetros, los que están siendo definidos y dirigidos a pacientes quienes por sus parámetros tumorales no esperan beneficios de estudios con nuevas drogas más convencionales.

Biología molecular en el diagnóstico y tratamiento del cáncer colorrectal

Grandes avances en el entendimiento de las bases moleculares del cáncer colorrectal han ocurrido durante las últimas dos décadas. Una cantidad de estudios claves, incluyendo la demostración de la acumulación progresiva de eventos mutacionales somáticos críticos durante la secuencia de adenoma a carcinoma (34), la identificación del gen de la poliposis adenomatosa coli (APC) en la poliposis adenomatosa familiar (FAP) (52) y de los genes de reparación de mismatch en el cáncer colorrectal hereditario no polipósico (HNPCC) (53), han provocado un mayor impacto en el campo de la biología en el cáncer colorrectal en particular y en la carcinogénesis humana en general. A la fecha, muchos de los impactos clínicos de los progresos científicos han sido aplicados a los ya mencionados y heredados, en forma autosómico dominante, síndromes de predisposición al cáncer colorrectal (FAP y HNPCC).

Muchos más beneficios clínicamente significativos de estos descubrimientos moleculares son indudablemente venideros, particularmente en las áreas de epidemiología molecular, diagnóstico, prevención y tratamiento del cáncer colorrectal.

Biología molecular y diagnóstico del cáncer colorrectal

FAP
La contribución de la biología molecular en el manejo de este síndrome ejemplifica uno de los sucesos históricos más obvios en la historia de los cánceres genéticos. FAP se caracteriza por transmisión autosómica dominante, altamente penetrante y desarrollo de cientos a miles de pólipos adenomatosos colorrectales, los cuáles inevitablemente progresan a cáncer colorrectal (54). Como estos rasgos de la FAP llegaron a ser bien reconocidos en la década de los 50, los cirujanos comenzaron a defender el screening endoscópico agresivo de los individuos de riesgo por tener familias con FAP y las colectomías cortas profilácticas después de evidenciar los pólipos. Al identificarse en 1991 las mutaciones del gen APC en el cromosoma 5q como la causa de la FAP (52), se dispuso de un acercamiento mucho más práctico para el manejo de las familias con esta enfermedad. Deleciones cortas o inserciones en el 5’ end of exon 15 de APC pueden ser detectados en las líneas germinales de muchos pacientes con FAP (55). Con esta información el testeo genético para la misma mutación en una familia específica provee un excelente test para evaluar y ofrecer recomendaciones acerca del screening más costo-eficaz en sujetos de riesgo. En otras palabras, aquel individuo que ha heredado el alelo mutante será asesorado a comenzar un screening intensivo a temprana edad, mientras que aquellos que tienen test negativo pueden evitar el riesgo, gasto, y disconfort de las frecuentes endoscopías (56). Posterior a la colectomía profiláctica, muchos pacientes con FAP pueden esperar una calidad y longitud de vida normal, aunque una fracción medible de individuos tendrán problemas relacionados con las dos características extracolónicas comunes de este síndrome: tumores abdominales desmoides y neoplasias periampulares. Estas últimas manifestaciones de la FAP dejan una serie de desafíos en los cuidados físicos de estos pacientes (54). Aunque cargado de importantes desafíos éticos y técnicos, la corrección de la anormalidad genética en la FAP, llámese reemplazo del alelo mutante APC, podría ser vista como la meta potencial para la próxima generación de “terapias génicas”.

Una variante común de APC, el alelo I1307K, fue recientemente identificado en 6% a 7% de los individuos descendientes de judíos Ashkenazi, asociándose a mayor riesgo de cáncer colorrectal.

HNPCC
Una fuerte agrupación familiar de cánceres colorrectales y otros cánceres extracolónicos (endometrial, gástrico, intestino delgado, ureteral, hepatobiliar) ha sido reconocida como un inequívoco “síndrome de cáncer familiar” por Lynch y otros por muchas décadas (57,58). Sin embargo, el defecto genético específico responsable de este síndrome era desconocido hasta hace poco. Un gran cambio en los cánceres genéticos ocurrió en 1993 seguido del descubrimiento de los genes reparadores del mismatch del DNA humano. Las mutaciones de las líneas germinales de los genes reparadores mismatch han sido demostradas en aproximadamente el 50% de los individuos con historia clínica de HNPCC (59,60). Aunque seis genes reparadores mismatch humanos han sido clonados a la fecha (53), mutaciones en la línea germinal de MSH2 o MLH1 se han informado en más de 90% de las familias genéticamentes definidas con HNPCC (61). El gran significado clínico de los tumores de pacientes con HNPCC puede ser identificado a nivel molecular por la demostración de alteraciones frecuentes a lo largo de la secuencia del DNA, secuencias repetitivas en el genoma referidas como microsatélites (comúnmente llamadas como inestabilidad microsatélite de alta frecuencia o MSI-H ) (62,63). Este fenotipo molecular es detectable usando DNA genómico de tejidos con cáncer colorrectal frescos o fijados en parafina, sirviendo como una herramienta útil para caracterizar a las familias sospechosas de HNPCC quienes pueden beneficiarse del testeo genético para mutaciones MSH2 o MLH1. Considerando el alto riesgo vital del cáncer colorrectal y otros cánceres en aquellos portadores del riesgo de mutaciones de genes reparadores mismatch de líneas germinales, estos sujetos son buenos candidatos para nuevas estrategias de prevención y screening de cáncer.

Porque sólo el 1%-2% de todos los casos de cáncer colorrectal son causados por FAP y HNPCC, es probable que otros genes de predisposición a cáncer colorrectal sean identificados en el 20% o más de los casos con historia familiar de la enfermedad.

Herramientas para la detección temprana de neoplasia colorrectal

Los síndromes de cáncer colorrectal hereditario son buenos ejemplos de la importante contribución de los descubrimientos genético-moleculares en la identificación y consejo genético de muchos sujetos de alto riesgo con mutaciones en líneas germinales de genes supresores de tumor. Al mismo tiempo, un entendimiento de los cambios moleculares somáticos durante la tumorogénesis colorrectal están comenzando a afectar el desarrollo de nuevas estrategias de screening. Hoy es bien reconocido que mutaciones somáticas APC y K-ras son detectadas durante las etapas más tempranas de la neoplasia colorrectal, eso es, en pólipos adenomatosos diminutos (64) e incluso en focos crípticos displásicos aberrantes (56), un precursor microscópico putativo de cáncer colorrectal. Años atrás, el grupo de Vogelstein mostró que las mutaciones del K-ras pueden ser detectadas en pacientes con pólipos y con cánceres (66), de este modo se formó la fundación para nuevos estudios dirigidos a diseñar nuevas técnicas de detección molecular como test de screening para cáncer colorrectal. Un reporte reciente de Ahlquist y cols. Demostró la alta sensibilidad y especificidad para este acercamiento, con el uso de un panel de marcadores moleculares incluyendo K-ras, p53, APC, y el marcador microsatélite BAT (67). La especificidad fue tan alta como 100% usando algunos de los marcadores (67). Grandes estudios prospectivos son una guía para determinar la potencial utilidad clínica de estos tipos de técnicas de screening moleculares somáticas.