Mecanismo de acción del oligonucleótido antisentido

La terapia génica funciona por colocación o sustracción de genes. En este caso, se intenta sustraer o disminuir la expresión del gen que produce el RNA mensajero que va al citosol, mediante la fabricación de una molécula reversa que previene la traducción y producción de esta proteína, según las leyes de Watson y Creek. Hasta hace poco se pensaba que este mecanismo era el único mecanismo de acción de las moléculas antisentido, pero al parecer ni siquiera sería el más importante.

Las moléculas utilizadas son trozos de ADN (oligo-deoxinucleótidos) cuyo átomo de oxígeno se reemplaza por azufre, el que evita que las nucleasas rompan estas moléculas y alarga considerablemente su vida media, hasta 2-5 días en la rata y 10-14 días en el hombre. Es posible introducir un gen que las produce y los estudios realizados hasta ahora demuestran que la administración de una dosis única podría durar hasta dos años.

En 1998 se comenzó a estudiar la forma de fabricar un antisentido eficaz. La conferencia de consenso sobre NASH, de esa época, fue decepcionante para las compañías, que habían invertido mil millones de dólares en la producción de estas moléculas, porque aunque se logró producir un antisentido viral, que se encuentra aprobado por la FDA y ya está en el mercado, se concluyó que la única manera de generar un oligómero antisentido activo era por ensayo y error, con la preparación de 30, 40 o más moléculas y la selección de la más eficaz.

Se conocía la secuencia de 30.000 genes y se pensaba que con eso bastaba para elegir el más adecuado, pero la conferencia de consenso estableció que no era así, porque no se había tomado en cuenta el hecho de que la molécula de RNA está doblada sobre sí misma, lo que impide que las moléculas antisentido se unan a ella.

Nuestro grupo tuvo la misma dificultad al tratar de fabricar antisentidos contra la producción de TNF, basados en el gen del TNF alfa. Después de obtener 18 moléculas, se determinó la producción de TNF alfa en células de Küpfer aisladas de rata, se cultivó estas células durante uno o dos días y se agregó posteriormente una pequeña dosis del lipopolisacárido de endotoxina, que aumenta mil veces la producción de esta citoquina. Sólo una de estas moléculas (6%) tuvo un efecto inhibidor intenso de la producción de TNF alfa en células tratadas con el antisentido, en comparación con células control, tal como era de prever por lo que se establecía en el consenso.

Luego de estudiar acuciosamente los antisentidos que habían producido algún efecto, se determinó que uno era una molécula que actuaba donde empieza a leerse el gen, en el área AUG, lugar donde se adhieren los ribosomas para empezar a leer y producir la proteína, ubicado en un exón, en un área 3 prima no traducida. La otra molécula estaba ubicada en un intrón.

Estudiando la actividad de estas moléculas se encontró que la del intrón era bastante más activa y que su efecto a 200 nanomolar era incluso un poco mejor que el de la otra molécula a 1.000 nanomolar; es decir, era bastante mejor inhibidor, no sólo en cuanto a su potencia, sino también en cuanto a que necesitaba una dosis muy baja. Este antisentido funcionaba por detención de la traducción, cubriendo el área que se une a los ribosomas.

Posteriormente, se estudió el funcionamiento del antisentido que actúa en un intrón, con el objetivo de buscar la forma de fabricar moléculas de antisentido eficaces. Se evaluó el efecto sobre la producción de TNF alfa, pero actualmente, en nuestro laboratorio de Santiago de Chile, se está estudiando el receptor TNFR1.

La molécula inicial resultó muy buena, pues tenía 92% de inhibición y dejaba la producción de TNF alfa en 8% del valor inicial, es decir, era una molécula muy activa a una concentración muy baja. Después se observó que el área del RNA marcada por el antisentido podía moverse efectivamente hasta 10 a 15 bases hacia cualquiera de los dos lados del área original, lo que indicaba que cubría algo importante. Luego se demostró que ese algo eran áreas GGGA, que serían las llaves maestras para producir un antisentido.

Con esta observación en mente, se revisó la literatura mundial para determinar si otros antisentidos eficaces que se habían logrado también tenían relación con esta secuencia GGGA. De 1.800 estudios, 10 habían preparado entre 10 y 100 moléculas y al analizarlas se comprobó que esta secuencia estaba presente en 48% de los oligonucleótidos antisentido más potentes descritos en la literatura, aunque los investigadores no se habían dado cuenta. Así se encontró la llave maestra para fabricar antisentidos.

Este hallazgo se utilizó para predecir prospectivamente las secuencias de nuevos oligonucleótidos antisentido para la copia primaria del mRNA de TNF alfa de la rata. Más de 50% (13 entre 22) de los antisentidos construidos con la secuencia complementaria TCCC pudieron inhibir efectivamente la síntesis de TNF alfa, y también se observaron marcadas reducciones en el mRNA. Esta secuencia resultó más eficaz cuando tuvo como objetivo intrones ubicados en la copia primaria del RNA; esto indicaba una localización nuclear para la acción del antisentido. El otro 40% correspondía a los extremos y era previsible que no funcionaran.

Lo interesante fue que las moléculas que menos funcionaban estaban en los exones, lo que demostraba que esto no funciona en el citosol. O sea, no es que el RNA salga del núcleo y quede atrapado con un antisentido; esto funciona dentro del núcleo, porque solamente en éste existe una traducción intrónica, gracias a la presencia del RNA producido por los intrones.

Otro hallazgo interesante fue que había otro mecanismo de acción. Antes se pensaba que los oligodeoxinucleótidos antisentido se ligaban al mRNA blanco y gatillaban la ruptura, mediada por ribonucleasa H, de la molécula doble de RNA-DNA recién formada, ya que esta nucleasa rompe las combinaciones que considera extrañas. Sin embargo, datos experimentales in vitro e in vivo han demostrado que los antisentidos no necesariamente reducen los niveles del mRNA correspondiente; de hecho, los niveles de mRNA pueden estar claramente elevados.

Estos resultados sugieren que los oligodeoxinucleótidos antisentido, probablemente, en un gran número de aplicaciones neurobiológicas, funcionan mediante una detención híbrida de la traducción y actúan como un imán que une dos hebras, más que por ruptura del mRNA dirigida por ribonucleasa.

En el experimento descrito, la molécula más activa, que inhibía 92% de la producción de TNF, causaba la desaparición total del mRNA y cuanto más activa la molécula, mayor era la ruptura o desaparición de aquél. La molécula, que tenía 48% de efecto, funcionaba en el AUG mediante detención de la traducción y no poseía la capacidad de romper el RNA.

O sea, la llave maestra no sólo debe encontrar la molécula de RNA sino que también debe romperla. Los dos mecanismos que permiten la producción de antisentidos funcionan muy bien con el TNF alfa; en Chile se ha probado prospectivamente y la fórmula se ha entregada a otros investigadores, quienes han encontrado eficacia en alrededor de 50% de las moléculas.

El paso siguiente fue tomar este antisentido y administrarlo a animales para determinar el efecto inhibitorio de la producción de TNF alfa in vivo. Sin embargo, para llegar a las células de Küpfer es necesario administrar grandes dosis del antisentido, que de esta manera también llega a los hepatocitos y a las células endoteliales. Para lograr que entrara sólo a las células de Küpfer, se encapsularon las moléculas en pequeños lípidos, del tamaño de una bacteria. Como las células de Küpfer son fagocitos, fagocitaban el liposoma que contenía una pequeña partícula de antisentido TNF rodeado por lípidos.

El antisentido encapsulado constituye una forma farmacéutica viable que se puede transportar y enviar a cualquier parte en frío, pues dura 30 días a 4° Celsius. El problema es que es muy estable a pH 7,4, pero muy inestable al pH que existe en los endosomas, de modo que cuando las células de Küpfer toman estos liposomas, construidos en forma tan especial y cargados con antisentidos, y los entregan hacia el núcleo, pueden romperse debido al pH, sin entregar su carga farmacológica.

Para encontrar la solución a este problema, se hizo un estudio en animales con administración de tres dosis en diferentes tiempos, seguidas de una inyección de lipopolisacáridos 48 horas después de la última dosis y del análisis del efecto sobre TNF alfa. Se observó una gran inhibición de la producción de TNF en el plasma y 70% de inhibición de la producción de TNF en cortes de hígado.

Para demostrar que las células de Küpfer captaban esto específicamente, se administraron moléculas marcadas con carbono 14 o fósforo, que entra principalmente al hígado y al bazo, los órganos macrofágicos que producen el TNF, y se comprobó que la cantidad de TNF era 8 a 10 veces mayor en las células de Küpfer que en las células endoteliales y los hepatocitos, que prácticamente no tenían TNF.

En otras palabras, se produjo un antisentido contra TNF alfa, se encapsuló, se inyectó de manera que lo captaran células de Küpfer activadas con lipopolisacáridos y éstas sufrieron una gran inhibición después de administrar dos dosis del antisentido.

En este momento, los investigadores de la Universidad Thomas Jefferson están presentando, en él Liver Meeting de la Sociedad de Hepatología, el estudio que demuestra que el oligonucleótido antisentido contra TNF alfa previene la toxicidad que causa la administración de alcohol y lipopolisacáridos en ratas in vivo, cuyos resultados definitivos se entregarán en noviembre de este año.