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Genética y sarcoma de Ewing

Genetics and Ewing sarcoma

Resumen

Este texto completo es la transcripción editada y revisada de una conferencia dictada en el III Curso de Oncología Musculoesquelética y Sarcomas Óseos, Módulo I: Sarcoma de Ewing. Generalidades, organizado en Santiago por la Sociedad Chilena de Traumatología y Ortopedia del 16 al 18 de agosto de 2000.
Director Curso: Prof. Asistente Dr. Miguel Sepúlveda H.
Coordinadores: Dr. Orlando Wevar C., Dr. Julio Arriagada V.

Introducción
El sarcoma de Ewing es un endotelioma óseo difuso, de células pequeñas, redondas y azules, que afecta a huesos largos tubulares y/o planos. Se presenta en niños y adolescentes. Es un tumor con diferenciación neural, cuya localización más frecuente es la pelvis y el eje axial. Se caracteriza clínicamente por un aumento de volumen doloroso, puede haber fiebre, planteándose el diagnóstico diferencial con osteomielitis aguda. Es de alto grado y de muy mal pronóstico.

Al hablar de citogenética y biología molecular, hay que saber que toda la información que aparece es más bien teórica, y muchas veces no tiene sentido. Lo importante es conocer las técnicas modernas basadas en extracción y replicación del DNA, que pueden realizarse actualmente en todos los laboratorios. Entre éstas podemos mencionar la PCR (reacción en cadena de polimerasa ) y el Fish, que es una técnica de hibridación in situ que se usa para diagnóstico de paternidad

Con respecto a las técnicas de biología molecular, las hay de dos tipos. Ambas presentan dificultades, debido a que los tejidos óseos necesitan ser decalcificados con ácido, procedimiento que produce desnaturalización del material nucleico y dificulta el estudio. Además, necesita ser enviado al laboratorio congelado, de modo de mantenerlo disponible y fresco. Se fija con formol u otra solución, cuidando siempre de no estropearlo.

Técnicas de biología molecular: estudios in situ
Se orientan al aspecto citogenético y analizan la parte celular y nuclear.

  • Fish: consiste en hibridizaación in situ.
  • Prins: utiliza “primers”, marcados para establecer nuevas secuencias de nucleótidos, que se amplifican mediante una DNA polimerasa; posteriormente se mide el desplazamiento en un gel de agarosa que determina la cantidad expresada.
  • RT-PCR: reacción en cadena de polimerasa/transcriptasa reversa. Se toma un oligonucleótido conocido y se trata de hibridizar con el DNA que tiene la secuencia que queremos conocer; luego de lograr eso amplificamos esta nueva secuencia y vemos lo expresado. Con la transcriptasa reversa se puede hacer a base de RNA mensajero, pero tiene el inconveniente de que éste es más lábil.

Técnicas de biología molecular: estudios in vitro
Se efectúa extracción y análisis de los ácidos nucleicos, lo que significa una destrucción celular, que posee la desventaja de que no se sabe si está analizando la célula tumoral o la normal.

  • Southern Blot: se trata de buscar con oligonucleótidos la secuencia de DNA que queremos estudiar.
  • PCR: reacción en cadena de polimerasa. Es una técnica relativamente rápida y simple para amplificación del DNA. Permite la creación de millones de copias idénticas de una secuencia de DNA de interés, la que es extraída de la muestra en estudio y es única para la enfermedad que queremos diagnosticar. A esta muestra se le añaden los primers, que son oligonucleótidos sintéticos específicos que ligan la secuencia de DNA en estudio y permiten que la DNA polimerasa cree millones de copias de esta secuencia, la que amplificada puede ser medida fácilmente por electroforesis en gel.
  • RT-PCR: ya descrita.
  • Análisis de mutaciones: son exámenes muy nuevos. En ellos se busca una mutación específica en poblaciones blanco definidas, como los Li-fraumeni y poblaciones que tienen una alta posibilidad de cáncer. Son muy lentos. Se trata de que el primer utilizado no sea muy costoso y esté disponible, que cada estudio no se demore más de tres o cuatro días, y pueda ser utilizado en el tejido que tenemos. Algunos de estos estudios pueden efectuarse en placas histológicas o en muestras en parafina, hecho muy importante porque nos permite analizar el resultado citogenético o molecular junto al resultado histológico que da el microscopio convencional.

Traslocación cromosómica en sarcoma de Ewing
No se produce un oncogen o un gen supresor alterado, sino que dos genes se parten en un punto (breaking point) distinto y se unen en un cromosoma formando un gen quimérico que establece una secuencia de codificación para un RNAm híbrido, alterado, pero que es reconocido como válido (recordemos que en la mitología, la quimera era un ser que tenía partes de distintos animales). Este RNA híbrido va a producir una nueva proteína, también quimérica, que tiene que ver con muchos factores de transcripción, los ews (fli-1,erg,wt-1), produciendo una gran alteración celular que se manifiesta como el sarcoma de Ewing.

El gen ews está en el cromosoma 22 y actúa como iniciador de la transcripción (promotor), estimulando al otro fragmento de gen, llámese fli-1, erg o wt-1, dependiendo del cromosoma en donde esté, para que comience la transcripción de DNA en el sitio de inicio o binding site. Promueve la transcripción de esos tres fragmentos genéticos. Se ubica en los cromosomas 11 y 22 para el típico Ewing, en las bandas q24 y q12. El 90% de los Ewing, PNET o Askin lo tiene. Se observa como el cromosoma 11 y el 22 se parten con un breaking point distinto, quedando un gran cromosoma y otro pequeño.

También puede ocurrir una traslocación entre los cromosomas 21 y 22 que explica el otro 10% de los Ewing y PNET, el (ews)-(erg). Igualmente, el primero es promotor de la transcripción del segundo, produciendo una nueva proteína no del todo diferente, ya que produce el mismo fenotipo que el Ewing y también PNET, pero en dos cromosomas distintos.

También existe la traslocación entre el cromosoma 7 y 22 con (ews) y (etv-1). No está muy claro cuál sería su efecto, incluso no está clara su relación con el sarcoma de Ewing, pero tampoco se ha descartado.

Más interesante es la traslocación 11-22, pero con la interacción del gen (ews) como promotor y el gen (wt1), que se encuentra en los tumores peritoneales de alto grado y en el tumor de Wilms, y que participa en la diferenciación blastémica renal del embrión. Esto podría explicar el comportamiento tan maligno del tumor de Ewing, ya que al formarse en una línea celular tan primitiva de diferenciación blastémica se producirían las traslocaciones.

Se muestra una lesión tumoral en una paciente de 14 años. Mediante PCR se determinó que era un sarcoma de Ewing, a pesar de que la histología revelaba un condrosarcoma mesenquimal.

En el siguiente esquema se muestra cómo están relacionados entre sí varios tipos de tumores.

Estos tumores poseen diferenciación neural, son primos hermanos del Ewing, del tumor de Askin que afecta a la caja torácica de niños, del osteosarcoma de células pequeñas, que se diferencia de los otros por la producción de osteoide, y del condrosarcoma mesenquimal. Las traslocaciones hacen que se fusionen y tenga diferentes posibilidades, pero es la misma base neural o muy primitiva.

También existen los sarcomas pluripotenciales que expresan todo tipo de genes. Son sarcomas de diferenciación neural que pueden diferenciarse hacia mioblasto, músculo y hueso. Expresan traslocaciones similares a la del Ewing, formando una familia de tumores muy básicos o embrionarios, y por lo tanto, muy malignos.

A pesar de existir una gran cantidad de publicaciones acerca de la citogenética de los Ewing, la mayor parte es información muy densa y poco útil, debido a que falta la correlación con los clínicos. Lo que hay que saber es que el Ewing y los PNET vienen a ser lo mismo, y dependen de que se exprese el gen fusión ews/fli-1; que la proteína de superficie P30/32 es la expresión del gen myc-2, y que todo esto se define con los antígenos HBA 71, 12E7, 013, etc.

La proteína de superficie se puede detectar en el 100% de los casos mediante la utilización de anticuerpos, permitiendo establecer el diagnóstico de sarcoma de Ewing con esta sola medición, evitando confusiones y errores de manejo.

Todo esto puede ser útil desde la historia del paciente, a partir de la cual se produce un ejercicio académico, clínico, radiológico y patológico con todas las variantes que existen; y en las cuales con frecuencia se requiere cirugía mutilante, de mal pronóstico, o cirugías reconstructivas, cuyo pronóstico ha mejorado. Sin embargo, aún fallamos en el diagnóstico precoz y en la determinación precisa del pronóstico, a pesar de que los protocolos de quimioterapia han mejorado.

Lo que falta actualmente, es obtener marcadores adecuados para estratificar mejor a los pacientes y saber cuáles responderán bien y cuáles no, idear tratamientos novedosos para los que no van a responder. Esta es una buena ruta, ya que en la mayoría de los centros existen los sistemas para los estudios de DNA. La mejor manera de empezar es marcar nuestros tumores para el diagnóstico, proceso que se efectúa mediante PCR.