Introducción
Para identificar la expresión genética y secuencias específicas de los ácidos nucleicos, se han d+D2:I2esarrollado varias técnicas de biología molecular, siendo la más utilizada la PCR convencional (Calero et al., 2014; Rodríguez et al., 2015). Sin embargo, esta técnica tiene algunos inconvenientes, puesto que al ser un método cualitativo, no permite cuantificar el producto de la PCR ni estimar sus densidades iniciales (Barrera et al., 2016).
Con la finalidad de evaluar el avance de la síntesis del DNA durante la reacción de PCR, a los ingredientes habituales de la misma (desoxirribonucleótidos: dNTPs, ADN polimerasa, cebadores o primers, tapón de reacción), se adiciona una sustancia marcada con un fluoróforo (técnica TaqMan), o sustancias fluorescentes intercalantes de DNA (Método Sybr Green) que permiten cuantificar la tasa de generación de los productos de PCR específicos. Esta variante es conocida como PCR cuantitativa (qPCR) o en tiempo real (Biassoni & Raso, 2014).
La aplicación de esta técnica es de considerable utilidad en el desarrollo de investigaciones relacionadas en biología molecular aplicada, como por ejemplo en la detección de la diseminación de genes de resistencia a antibióticos en diferentes muestras ambientales (ríos, lagos, suelos, estiércol de animal entre otros), considerados en la actualidad como contaminantes emergentes (Calero et al., 2016). Actualmente, la PCR en tiempo real permite estudiar secuencias específicas de ADN de interés para la investigación aplicada en la medicina, la conservación medio ambiental y la industria (Garrido et al., 2013).
Objetivos
Validar técnicas de PCR cuantitativa (qPCR) para la cuantificación de genes de resistencia a antibióticos
Diseñar un estándar plasmídico para el gen tetW y purificar estándares a partir de bacterias portadoras de plásmidos recombinantes para los genes blaTEM, sul1, qnrS, ermB y 16S rDNA.
Realizar los experimentos de obtención de las curvas estándar en el termociclador en tiempo real, utilizando los métodos Sybr Green para el gen ermB y TaqMan para los genes blaTEM, sul1, qnrS, tetW y 16S rDNA.
Obtener las ecuaciones, líneas base (thresholds), límite de cuantificación, eficiencia y especificidad para los genes blaTEM, sul1, qnrS, tetW, ermB y 16S rDNA.
Método
El presente trabajo tuvo como objetivo validar técnicas de PCR en tiempo real, empleando técnicas TaqMan y Sybr Green. Para llevar a cabo la cuantificación en el termociclador 7500 Fast Real- Time PCR System, se utilizó estándares puros de los diferentes plásmidos recombinantes (blaTEM, sul1, qnrS, ermB y 16S rDNA) y en el caso del gen tetW se diseñó un estándar plasmídico sintético, para elaborar las curvas estándar a partir de un banco de diluciones seriadas de cada gen.
Principales Resultados
Se realizó los experimentos de obtención de las curvas estándar, utilizando los métodos Sybr Green para el gen ermB y TaqMan para los genes blaTEM, sul1, qnrS, tetW y 16S rDNA, para los cuales se obtuvieron eficiencias superiores a 97,4% y correlaciones lineales mayores a 0,99; encontrándose dentro de los rangos recomendados.
Se obtuvo las ecuaciones de cada recta por medio de las gráficas de dispersión, las líneas base, la especificidad de los primers, las cuales se verificaron utilizando el programa informático de alineamiento de secuencias BLAST y los límites de cuantificación que se encontraron entre Ct 34,4 a 34,8.
Conclusiones
Se implementaron técnicas de PCR cuantitativa (qPCR) aplicando diferentes técnicas (TaqMan y Sybr Green) y estándares de plásmidos recombinantes así como de fragmentos sintéticos. Para cada uno de los genes, los resultados demostraron una alta sensibilidad y especificidad. Por tal motivo, se utilizarán como una herramienta para evaluar la diseminación de genes de resistencia a antibióticos en diversas matrices ambientales que estudia el grupo de investigación UTA RAM One Health de la Universidad Técnica de Ambato.
Se diseñó un estándar plasmídico sintético para el gen tetW, cuya especificidad teórica y experimental fue comprobada, siendo esta una alternativa aplicable especialmente en la industria, cuando no se puede contar con estándares de los genes deseados o no se cuenta con sistemas de clonación en plásmido.
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